98. Jahrestagung der DOG 2000

P 12

Ein HC-Adenovirus (HC-Ad) Vektor transduziert RPE-Zellen von Ratten
in vitro und in vivo mit hoher Effizienz

T. T. Luther, F. Kreppel, P. Esser, K.-U. Bartz-Schmidt, S. Kochanek,
U. Schraermeyer

Einleitung:Nach der molekularen Aufklärung einiger hereditärer Netzhauterkrankungen gilt die Gentherapie als vielversprechender neuer Therapieansatz in der Augenheilkunde. Ziel dieser Arbeit war es, einen neu entwickelten high capacity Adenovirus (HC-Ad) Vektor auf seine Fähigkeit hin zu untersuchen, retinale Pigmentepithelzellen (RPE) der Ratte zu transduzieren. HC-Ad Vektoren sind durch eine hohe Kapazität für die Aufnahme fremder DNA von 36 kb und das Fehlen viraler kodierender Sequenzen charakterisiert.

Methoden:Ein HC-Ad Vektor (AdFK7) wurde hergestellt, der das enhanced green fluorescent protein (eGFP) unter Kontrolle des hCMV Promoters exprimiert. Für die Versuche an RPE Zellen in vitro wurden Ratten mit CO2-Narkose getötet und die Augen wurden enukleiert. Behandlung der Augenbecher mit Ca++-freier BSS-Lösung ermöglichte die frische Präparation von RPE Zellen. Anschließend erfolgte die Kultivierung. Diese RPE Zellen wurden mit verschiedenen Titern (20, 50, 100 MOI) des HC-AdFK7 über 24 Stunden inkubiert. Für die in vivo Experimente wurden unterschiedliche Mengen (5x106 und 5x105 gfu) infektiöser Partikel des Vektors in einem Volumen von 0,5 µl in 60 Tage alte Wistar Ratten subretinal injiziert. Nach 3 Tagen erfolgte die Tötung der Tiere, die Enukleation und Fixation der Augen und Präparation der Schnitte zur lichtmikroskopischen Untersuchung. Die Beurteilung der GFP-Fluoreszenz fand an den Schnittpräparaten bzw. an den Kulturschalen durch Fluoreszenzmikroskopie statt.

Ergebnisse:Die eGFP-Expression hielt in vitro über mehr als 4 Wochen (bisheriger Beobachtungszeitraum) lang an. Bei den in vivo Experimenten wurden in allen benutzten Konzentrationen das retinale Pigmentepithel der Ratte spezifisch und quantitativ im Injektionsgebiet transduziert. Die Fluoreszenz war in den in vivo Präparaten mit Cytokeratinexpression kolokalisiert.

Schlußfolgerungen:In dieser Arbeit wird nachgewiesen, dass HC-Ad Vektoren eine effiziente Transduktion von RPE Zellen in vitro und in vivo erlauben. Somit bietet sich dieser Vektor für funktionelle Untersuchungen in RPE Zellen und auch für gentherapeutische Verfahren im hinteren Augenabschnitt an.

Universitäts-Augenklinik und Zentrum für Molekulare Medizin (ZMMK) Köln, Joseph-Stelzmann-Str. 9, D-50931 Köln



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